常用荧光染料激发与发射峰值参数|荧光显微镜滤光片如何选择
时间：2026-09-27 浏览：1
一、荧光显微镜常用激发/发射波段及代表荧光染料
通道 | 典型激发 | 常用检测范围 | 代表荧光染料/蛋白 |
紫外/紫蓝 | 350–405 nm | 440–500 nm | DAPI、Hoechst 33342/33258、Pacific Blue、Cascade Blue |
青蓝/蓝绿 | 405–445 nm | 470–520 nm | CFP、BFP、Alexa Fluor 430、部分钙指示剂 |
绿色 | 488 nm | 500–540 nm | GFP、FITC、Alexa Fluor 488、mNeonGreen、SYTO 9、Calcein AM |
黄绿 | 514–532 nm | 530–570 nm | YFP、EYFP、Venus、Citrine、Alexa Fluor 514 |
橙红 | 550–568 nm | 570–620 nm | TRITC、Cy3、Alexa Fluor 555/568、Rhodamine、DiI |
红色 | 561–594 nm | 600–650 nm | mCherry、Texas Red、Alexa Fluor 594、PI、MitoTracker Red |
远红 | 633–647 nm | 660–700 nm | Cy5、Alexa Fluor 647、APC、MitoTracker Deep Red |
近红外 | 680–690 nm | 700–760 nm | Cy7、Alexa Fluor 680、IRDye 680/700/800 |
一些常见染料的具体峰值可参考：
荧光剂 | 激发峰值 | 发射峰值 |
DAPI | 约 358 nm | 约 461 nm |
Hoechst 33342 | 约 350 nm | 约 461 nm |
GFP | 约 488 nm | 约 509 nm |
FITC | 约 495 nm | 约 519 nm |
Alexa Fluor 488 | 约 495 nm | 约 519 nm |
YFP/EYFP | 约 514 nm | 约 527 nm |
TRITC | 约 557 nm | 约 576 nm |
Cy3 | 约 550 nm | 约 570 nm |
Alexa Fluor 555 | 约 555 nm | 约 565 nm |
Alexa Fluor 568 | 约 578 nm | 约 603 nm |
mCherry | 约 587 nm | 约 610 nm |
Texas Red | 约 596 nm | 约 615 nm |
Alexa Fluor 594 | 约 590 nm | 约 617 nm |
PI | 约 535 nm，宽谱 | 约 617 nm |
Cy5 | 约 650 nm | 约 670 nm |
Alexa Fluor 647 | 约 650 nm | 约 665 nm |
APC | 约 650 nm | 约 660 nm |
Alexa Fluor 680 | 约 679 nm | 约 702 nm |
实际数值会因仪器、滤光片、溶剂和偶联物略有不同，应以试剂说明书和仪器滤光片参数为准。
二、常见滤光片组
滤光片组通常写成“激发滤光片 / 二向色镜 / 发射滤光片”。
滤光片组 | 典型配置 | 主要用途 |
DAPI/蓝色 | EX 350–400 nm，EM 450–490 nm | DAPI、Hoechst、细胞核 |
GFP/FITC | EX 450–490 nm，EM 500–550 nm | GFP、FITC、Alexa 488 |
TRITC/Cy3 | EX 530–560 nm，EM 570–640 nm | TRITC、Cy3、Alexa 555/568 |
Texas Red/mCherry | EX 540–580 nm，EM 600–680 nm | mCherry、Texas Red、Alexa 594 |
Cy5/远红 | EX 620–650 nm，EM 660–720 nm | Cy5、Alexa 647、APC |
Cy7/近红外 | EX 650–690 nm，EM 700–760 nm | Cy7、Alexa 680、部分活体成像 |
带通滤光片的写法也很常见，例如：
· 525/50：大约 500–550 nm
· 600/50：大约 575–625 nm
· 700/75：大约 662–738 nm
三、按实验目的选择染料的例子
实验目的 | 常用染料 |
细胞核 | DAPI、Hoechst 33342、PI、SYTOX |
活细胞核 | Hoechst 33342、SYTO 系列 |
死细胞/膜通透性 | PI、SYTOX Green/Red、7-AAD |
凋亡 | Annexin V-FITC、Annexin V-Alexa 647、TUNEL |
钙离子 | Fluo-4、Fura-2、Rhod-2、GCaMP |
线粒体 | MitoTracker Green/Red/Deep Red、MitoSOX |
溶酶体 | LysoTracker Green/Red/Deep Red |
内质网 | ER-Tracker Green/Red |
细胞骨架 | Phalloidin-Alexa 488/555/647、抗体标记微管 |
细胞膜 | DiI、DiO、DiD、FM 4-64、CellMask |
活性氧 | DCFH-DA、MitoSOX、CellROX |
pH | BCECF、pHrodo、LysoSensor |
抗体二抗 | Alexa Fluor 488/555/594/647、DyLight、Cy3、Cy5 |
四、实际选择时的几个原则
1、激发光要落在染料的激发带内
例如 488 nm 激光很适合 GFP/FITC，但 561 nm 激光更适合 mCherry、TRITC。
2、发射滤光片要放在发射带的主要区域，同时避开激发光
例如 GFP 用 500–550 nm 检测，而不是 480–500 nm。
3、多色实验要避免光谱重叠
GFP 和 FITC 通常不能很好地区分；YFP 和 TRITC 也容易串色。优先选择光谱间隔大的组合，如 DAPI / GFP / mCherry / Cy5。
4、远红和近红外通道背景更低
在组织、活体或自发荧光较强的样品中，Alexa 647、Cy5、Alexa 680 往往比绿色通道更干净。
5、必要时做单染对照和光谱拆分
多色荧光、自发荧光明显或通道串色时，应做单标对照并考虑光谱拆分/线性拆分。
五、荧光显微镜激发波长和发射波长是什么意思
荧光显微镜里，荧光分子经历一个循环：
吸收激发光 → 电子跃迁到高能级 → 短暂停留 → 回到低能级并发出荧光
对应两个关键波长：
激发波长（Excitation，λex）
荧光分子最容易吸收、从而被“点亮”的波长。实际实验中通常由激光器、LED 或激发滤光片决定。比如 GFP 常用 488 nm 激发。
发射波长（Emission，λem）
荧光分子回到低能级时发出的荧光波长。发射光通常比激发光波长更长、能量更低。比如 GFP 常在约 510 nm 检测。
两者之差叫 斯托克斯位移（Stokes shift）。因为激发光和发射光波长不同，显微镜才能用二向色镜和发射滤光片把弱的荧光从强的激发光里分离出来。
注意：
· 激发和发射都不是一个“单点”，而是很宽的谱带。
· 文献里的 488/509 这类写法，一般指峰值波长。
· 峰位会随 pH、溶剂、蛋白构象、偶联抗体等因素移动几纳米到几十纳米。
· 多光子显微镜是例外：用 800–1000 nm 近红外光做双光子/三光子激发，但发射仍可能在可见光区。